酵母种类对中国风格白酒中萜类成分的影响外文翻译资料

 2022-10-28 02:10

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酵母种类对中国风格白酒中萜类成分的影响

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2013.10.17获得

2014.07.10修订表格

2014.07.18网上可查阅

关键词：谷物 中国白酒 萜类化合物 酵母

摘 要

萜类化合物是中国白酒微量香味成分的饮食风格，是从谷物和豆科植物材料通过不同的酵母菌种在发酵过程中形成的。酿酒酵母，奥默毕赤酵母和酵母Wickerhamomyces艾诺玛路斯三种，在谷物和豆科植物提取物中，我们发现在从头和转化途径中酿酒酵母能够发酵产生十三种不同的萜类化合物。我们还发现，如高粱和大麦谷物和豆类如豌豆，含不同的萜类化合物的前体，其差异影响和萜类化合物的混合物形成。这项工作提供了新的见解，对中国轻型白酒中发现酵母物种产生各种萜类化合物的混合物起着重大作用。

介绍：

萜类化合物是一大类天然化合物，存在于植物和一些动物，其特点是其强大的和令人愉快的气味。它们具有重要的生物学作用，是所有生物体中的关键生物合成亚基。在植物精油中存在大量的萜类化合物，并发现在葡萄酒、啤酒和蒸馏酒精饮料也是如此。

中国轻型白酒是一个最古老的中国传统酒精饮料，并重视他们的自然和清新的味道。一个典型的例子是汾酒，与它著名的“淡淡的清香”风味。山西汾酒已超过1500年，并且获得了金牌在1915巴拿马太平洋国际博览会。

虽然很少有人知道他们的来源或形成方式，但是萜类化合物如芳樟醇、alpha;-松油醇，橙花叔醇、香叶醇、b-大马酮和金合欢醇是中国白酒风味成分的关键风味组成。

萜类化合物是在许多其他发酵饮料是重要的风味化合物。例如，对葡萄酒香气的主要萜类成分是芳樟醇、香叶醇、橙花醇、松油醇、香茅醇。这些萜类化合物是形成的过程已被调查，其受影响的主要有三个因素：酵母种类，葡萄品种和酿酒技术条件等。其他的研究表明，葡萄酒酵母如酿酒酵母，Hanseniaspora uvarum，Kloeckera apiculata，Torulaspora delbrueckii、Debaryomyces carsonii，促进并形成从葡萄中萜类化合物的前体。然而，它也被报道萜类化合物主要是由非酿酒酵母在葡萄酒的生产，而是由于这些物种的高b-糖苷酶活动。此外，三萜类化合物是汁水解物，发现乙酸香茅酯、金合欢醇。b-大马酮作为一种C13和类异戊二烯化合物，是一种气味活性成分葡萄酒。它已经在许多葡萄糖苷组分检测。中国轻型白酒是一种独特的自发性和固态发酵工艺。如图1所示，这一过程的特点是发酵剂大曲的使用，这是从一个经自然发酵的微生物群落形成。另一种是混合同步糖化发酵，它们在调节白酒类风味起着重要的作用。此外，与许多其他的饮料，无论是麦片、豆类作为发酵原料。

特定的微生物群落已被发现是发酵的关键（李等，2011），并包括十五种细菌和六种真菌的成员。这些真菌百分之六十酵母菌如酵母科或相关物种，包括酵母科属，Saccharomycetaceae sp., S. bulderi, S. castellii, S. cerevisiae,W. anomalus, T. delbrueckii, and Pichia kudriavzevii。因此，建议中国饮食风格白酒发酵是由微生物的特殊混合的影响和在过程中使用的谷物和/或豆科植物材料的类型。探索在中国饮食白酒类发酵的萜类化合物的形成机制，我们研究了各种本土酵母种类和不同的谷物或豆类材料对过程的影响。

图1. 中国风格白酒生产流程图

2．材料与方法

2.1．试剂和标准

所用的试剂和标准是从西格玛中购买的 奥德里奇（上海，中国），包括芳樟醇（gt; 95%），alpha;-松油醇（gt; 95%），香茅醇，香叶醇（gt; 95%）（gt; 97%），b-大马酮（gt; 95%），a-bisabolol（gt; 95%），金合欢醇（gt; 95%）、橙（gt; 97%），4-甲基-2-戊醇（gt; 98%），无水乙醇。

2.2．采样

在中国山西省一个汾酒酿酒厂进行抽样调查。在图1中显示了汾酒制备的方法。大曲作为发酵菌种，并自发发酵30 d的混合物大麦和豌豆粉用40%（重量/体积）水。发酵后的固体混合物，大曲贮存90 d，然后用九倍体积的高粱[这是以前30蒸40分钟–水地面（w/v 1.0:1.1）]，然后转移到陶罐（在1.1米的深度和半径0.35米），发酵约28在固态发酵谷物混合的乙醇含量（总数）达到4左右–6%（w/w）。这样形成的总数被放进了一个桶，并用蒸汽蒸馏提取乙醇和其他风味物质，然后进行白酒类收集.此前报道（李、黄、沈毅，2012）。最终酒的平均酒精度含量约为60%（体积/体积）。老化一段时间后，这些馏分混合，以产生最终产品的主要酒精度40%-55%（体积/体积）的内容。馏出物的风味主要是受原发酵颗粒性质的影响，采用蒸馏法程序本身具有较小的效果。

样品采自前白酒类发酵大曲粉，和样品糟醅从中心收集这个陶器发酵罐在5天的时间间隔期间28天的发酵过程。共获得八个样本。

2.3。酵母菌的计数，分离和鉴定

样品（10克）和90毫升无菌生理盐水（0.85%NaCl），浸泡在4摄氏度30分钟。部分（100会）的每一个所得到的悬浮液分散在沃勒斯坦实验室营养中，一式三份，这些悬浮液是在30摄氏度条件下培养5d.菌落培养进行宏观特征（纹理、表面、边缘、海拔和颜色），因此分为不同的类型。每种十至二十五个菌落和重新划线和孵育前，提供纯粹的克隆培养。

随机选取了5至8株每用PCR-RFLP分析不同的制约模式的26S rDNA D1/D2域的PCR产物。5.8S rDNA ITS区酵母分离的文学方法扩增，与化引物

、ITS4。样品的PCR产物与限制性内切酶Hha I，Hae III和Hinf I消化，它主要用于酵母的PCR-RFLP分析。对于转让的酵母菌种，并与限制型菌株，参考菌株和其他已发表的文件。参考菌株包括酵母，P. fermentans，P. membranifaciens，W异常，P.kudriavzevii，T.asahii和棍孢属酵母。确认的酵母菌种，对26S rDNA D1/D2域的PCR产物随机选取1–7株每不同的制约模式进行测序，并与GenBank序列比较。用于对26S rDNA D1/D2域区扩增引物1和NL4，正如先前所述。

2.4。发酵条件

从原料中得到的发酵培养基是从原料中得到的，从中得到的。两公斤每种材料结合去离子水8升蒸馏2h。然后将混合物在60摄氏度糖化4小时，其次是糖化酶给予终浓度为50 U/g.添加由此产生的混合物是在8000离心15分钟，上清液与分离。总还原糖的提取（最初90至95克/ L）被加入去离子水调整为90 g/L。通过添加乳酸发酵，6的原始pH值为5。提取物中的氮主要是蛋白质和肽，游离氨基酸总量约为1g/ L。谷物或豆类提取物培养基为蒸气压在121摄氏度15分钟。

将一滴培养酵母培养物基在30摄氏度接种酵母氮基24小时。这些种子培养标本接种于250ml三角瓶50ml无菌发酵培养基。发酵在150转和30摄氏度， 48小时进行一种非接种的发酵培养基的样品制备控制。用血球计数仪测定酵母细胞数。亚甲蓝被施加到估计的可行性的酵母。得到的是一个活力未染色细胞计数。每个实验三份。

2.5。前体提取物的制备

前驱体提取混合大麦、豌豆材料（6:4，w/w）通过以下方法。混合研磨成粉，和这个10克样品加入100毫升乙醇浸泡过夜，并在4℃.然后将混合物超声在30℃,30分钟，然后离心11000 g和4℃,10分钟。分离上清液，用100毫升甲醇提取残留。该混合物作为初始乙醇提取（上图）给第二部分上清液。上清两部分合并，浓缩至干，在35℃减少压力下使用（在0.098 MPa旋转蒸发器）。残留物溶解在0.01 M磷酸缓冲液20毫升（pH5.0），这种混合物的5毫升戊烷提取三次：乙醚（1:1）去除游离挥发性化合物。水溶性结合馏分分离并保留为前体提取物。

2.6。先驱体转化酿酒酵母细胞

酵母在150转和30℃、48小时在YNB培养基离心（11000g，5 min，4℃）50毫升样品的这些解决方案给细胞发酵固体颗粒，分别用双蒸馏水洗涤两次。细胞颗粒增加了前驱体溶液（已呈现之前，通过0.22-lm无菌过滤膜）。由此产生的悬浮液孵育在螺旋盖的玻璃管在150转和30℃、48小时所得混合物的上清液并存储在新的螺丝帽的玻璃管。

2.7。定量和半采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱的萜类化合物定量分析（HS-SPME-GC–MS）

通过HS-SPME-GC-MS测定原料提取物和发酵液的挥发性化合物.50 / 30的LM二乙烯基苯/ carboxen /聚（二甲基硅氧烷（DVB / CAR / PDMS）涂层纤维进行挥发性化合物的提取。固相微萃取的条件是基于报告的方法（德舒特et al.，2008），有轻微的修改。一个8毫升样品离心8000g，10 min.得到的上清液，内部标准（4-甲基-2-戊醇，在终浓度为54.50 lg／L）和3克氯化钠组合在一个20毫升小瓶与PTFE面硅胶隔膜密封。这个样本是平衡在50℃，5分钟，提取45 min后，在相同的温度下与固相微萃取能力的多用途采样器搅拌。提取后的DVB / CAR / PDMS涂层纤维插入气相色谱仪的设定在250℃注射口，离开5分钟洗脱分析物。所有分析均一式三份进行。

然后未知化合物的正确识别是通过比较质谱和保留指数（RIS）的纯标准。按照此前公布的计算系统的未知化合物保留指数。没有标准对照的化合物的确定由RIS与LRI相比（文献保留指数）。

这些挥发性化合物的单一标准储备溶液，由无水乙醇制备。用一系列浓度的pH值为5的工作液是由常备溶液制备是由稀释谷物或豆科植物材料发酵的培养液。在工作液的挥发性化合物含量最高的是：芳樟醇（168.5 lg／L），alpha;-松油醇（334.9 lg／L），香茅醇（188.4 lg／L），b-大马酮（46.7 lg／L），香叶醇（213.5 lg／L）、橙（81.5 lg／L），a-bisabolol（46 lg／L），和金合欢醇（96.3 lg／L）。依次稀释标准液做出的十多个标准曲线函数。所有的校准曲线有至少0.99的R2值。本文中所描述的其他化合物进行了半定量根据前面所描述的方法（罗，2008）。气相色谱-质谱分析，如前面所述（Chen，2010）。三是每个样品进行分析。

3．结果与讨论

3.1．中国风格白酒类发酵过程中酵母菌种鉴定

WLN是一个鉴别培养基，它可以根据对酵母的颜色和细胞集落形态基础进行初步鉴定（帕符曼等人，2001）。因此，这种培养基是用来评估在不同阶段的白酒的酿酒过程中的酵母生物多样性。总的来说，已从大曲和糟醅分离出398酵母菌，从形态特征的基础上，酵母菌被分为几组。各组代表株通过5.8S-ITS rDNA和D1/D2区先后次序的26S rRNA 的PCR-RFLP鉴定。如表1所示，原酵母被确定为包括10种，对应于酿酒酵母菌P.kudriavzevii,W.anomalus,Saccharomycopsis fibuligera, P. fermentans, Trichosporon asahii, Hanseniaspora osmophila, P. farinosa, P. membranifaciens and C. lusitaniae（补充资料图。S1和S2）。其中，大曲中只检测到S.fibuligera, C.lusitaniae, M. farinose and T.asahii，然而糟醅中，只检测到P.fermentans,H.osmophila and P.membranifaciens. 在大曲，S. fibuligera, P. kudriavzevii, S. cerevisiae and W. anomalus是占有优势的菌种，约65%的总的酵母是S. fibuligera、 19% P. kudriavzevii、10% S. cerevisiae 、 6% were W. anomalus.

表格1 中国白酒酿造过程中酵母种类的鉴定

菌种 PCR扩增产物（bp） 限制碎片的大小（bp） GenBank查询号

Hha I Hinf I Hae III

S. cerevisiae 880 370 360 145 360 350 180 320 230 180 130 JQ665243

P. fermentans 450 300 150 250 200 340

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