银杏叶提取物的化学分析与质量控制与其植物药学外文翻译资料

 2021-11-14 10:11

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银杏叶提取物的化学分析与质量控制与其植物药学

摘要

本文综述了银杏叶、银杏提取物、银杏植物药及部分中草药补充剂的化学成分分析与质量控制。

这篇综述是对在《T.A》(T.A.)早些时候发表的一篇类似综述的更新[T.A. van Beek, J. Chromatogr. A 967 (2002) 21–55].

自2001年以来，有关银杏叶的论文已超过3000篇，其中涉及广义化学分析的论文约400篇，现予以引用。

讨论了更重要的方法，并与2002年以前发表的最佳方法进行了比较。

在同一时期，超过2500项专利申请了银杏，却很少涉及到分析。

主要成分包括萜烯三内酯，即银杏内酯A、B、C、J、双黄酮类苷类、双黄酮类、原花青素、烷基酚类、单质酚酸、6-羟基kynurenic酸、4- o -甲基吡啶、多烯丙醇。在最常见的所谓“标准化”银杏提取物和植物药物中，有几个类别已不复存在。约有130篇新论文涉及萜烯三内酯的分析。它们大多是用甲醇或水或其混合物提取的。也可以采取超临界流体萃取和加压水萃取。样品的净化主要采用乙酸乙酯液-液萃取法，而与LC/MS/MS联合进行的样品净化则完全没有。采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)、ELSD法、RI法、质谱法、气相色谱/FID法、气相色谱/质谱法进行分离检测。水解后的LC/MS可以同时分析萜烯、三内酯和黄酮醇苷元。目前还没有对所有主要黄酮醇糖苷的定量方法，因为它们还没有上市。已经进行了一些可用糖苷的定量测定，但没有达到真正的目的。经酸性水解成苷元槲皮素、山奈酚和异鼠李肽后，用高效液相色谱法分离，定量简单，通过重新计算得到原总黄酮醇苷含量的估计数。真黄酮醇糖苷的图谱可以检测出储存不良或掺假。虽然银杏烷基酚口服后的毒性从来没有得到过明确的证实，但大多数供应商将银杏烷基酚提取物的含量限制在5ppm以内，并发表了几十篇关于其分析的论文。其中一种方法是直接在C8高效液相色谱柱上注射甲醇提取物，该方法在灵敏度(lt; 5ppm)、分离、简便性和有效性方面都优于传统方法，并将被纳入欧洲药典。此外，还可以使用GC/MS和ELISA方法。与大量关于萜烯三内酯、黄酮醇苷和银杏酸的论文形成鲜明对比的是，关于双黄酮、原花青素、简单酚类、简单酸和其他成分的论文数量较少，而这些成分构成了银杏标准化提取物的剩余70%。这方面的更多研究是显而易见的需要的。以银杏原花青素(7%)为例，目前尚无可靠的测定方法。最后，对银杏药代动力学和指纹图谱研究的文献进行了简要综述。

关键词：银杏、审查、质量控制、银杏内酯、白果内酯、黄酮醇苷、双黄酮、原花青素、烷基、银杏酸、聚戊烯醇、指纹识别

1.简介

银杏是古老的大型植物中唯一存活下来的物种,所有其他物种都已经灭绝了。这种植物化石的历史可以追溯到1.8亿年前。故银杏也被称为活化石[1-3]。银杏的介绍以繁体字为主，医学是相对较新的。在最古老的中国草药记载中并没有出现，神农本草经(公元前2800年)[1]和使用抗咳嗽、哮喘、遗尿、酒精滥用、化脓皮肤感染和肠病毒感染是Li Shih-chen在1596年的《草笔曹康木》中第一次提到[4]。对叶提取物的处方进行了改进的血液循环，无论是外围的还是中心的，都是从60年代在德国开始的[5]。目前的医疗适应症是间歇性跛行，老年精神衰弱(健忘，早期痴呆，注意力不集中)和耳鸣。银杏提取物如EGb761也被用作替代疗法抗阿尔茨海默病[6-8]。然而最近，一个大的(3069长期双盲临床试验(6.1年)(“GEM研究”)显示，标准化EGb761提取物没有效果预防任何类型的痴呆[9,10]。然而，银杏是目前销售和研究最多的药用植物之一。目前还没有准确的全球销售数据，但是在前一次审查中，大致数字为10亿美元引证了DeKosky等人在美国的年度销售数据为2.5亿美元[9]。这些数据十分容易得到并且被证实，根据SciFinder的搜索，不少于1930篇关于银杏的论文于2006-2007年发表或申请专利，每天超过2次。

银杏叶提取物可分为全叶提取物和叶提取物两种标准化提取物。前者通常用酒精调制并含有所有溶于酒精的成分。后者提取更常见，并且在含有6%的萜烯三内酯(TTLs)中，24%的黄酮醇苷含量低于5ppm银杏酸。这种萃取物的制备是一个多步骤的过程，但是这可能因制造商而异[11-13]。在这个过程中一些化合物(TTLs，类黄酮)得到了富集，而其他的(双黄酮，银杏酸)则被去除。通过混合黄酮醇糖苷中含量高、低的批次TTLs可以达到恒定的[14]质量。且都对产品进行广泛的质量控制他们的提取。主要化学物质的浓度首次标准化银杏萃取物(EGb761)见表1。一个有限的摘录列表的例子规格见表2。有时除了这些需求，原花青素含量，有机酸含量，个体银杏内酯A、B、C、J含量、溶解度、TTLs、黄酮醇苷、有机化合物的定性指纹图谱酸，13C NMR指纹图谱，硫酸盐灰，总有机残留量溶剂，分离残留乙醇和氯化溶剂，微生物污染，黄曲霉毒素，磷的存在和含氯农药，试管试验阳性反应对于特定官能团的存在，ph值各异检查金属种类和颗粒大小。很多这样的测试是众所周知的，在药典中描述的，而不是具体的银杏。因此，它们不会在本综述中讨论表3给出了一些参考。读者可进一步参考综述了坎波诺沃公司的工业质量控制Soldati [15]。关于银杏叶和标准化叶的专著提取物已经出现或正在为各种药典建设

所有认真的制造商都对产品进行广泛的质量控制他们的提取。主要化学物质的浓度首次标准化银杏萃取物(EGb761)见表1。一个有限的摘录列表的例子规格见表2。有时除了这些需求，原花青素含量，有机酸含量，个体银杏内酯A、B、C、J含量、溶解度、TTLs、黄酮醇苷、有机化合物的定性指纹图谱酸，13C NMR指纹图谱，硫酸盐灰，总有机残留量溶剂，分离残留乙醇和氯化溶剂，微生物污染，黄曲霉毒素，磷的存在和含氯农药，试管试验阳性反应对于特定官能团的存在，ph值各异检查金属种类和颗粒大小。很多这样的测试是众所周知的，在药典中描述的，而不是具体的银杏。因此，它们不会在本综述中讨论表3给出了一些参考。读者可进一步参考综述了坎波诺沃公司的工业质量控制Soldati [15]。关于银杏叶和标准化叶的专著提取物已经出现或正在为各种药典建设。

这篇综述是先前发表的综述的更新版本2002年在本刊[17]。和它的前辈一样，它主要是重点对化学分析的定量进行了主要的二次分析木犀草叶和提取物中的代谢物。萜烯三内酯，黄酮醇苷，双黄酮，原花青素，烷基酚，简单酚酸，6-羟基苯磺酸，4-O-methylpyridoxine polyprenols。在过去的6年里人们对银杏的质量控制和分析有着极大的兴趣增加(图1)。尤其是中文论文数量增加与2002年的回顾相比，这是一个巨大的进步。所有文件引用;然而，只讨论更有趣的问题。对各种分析方法进行了比较，并提出了建议考虑到。这篇综述的新内容是关于指纹识别的讨论。也对专利文献进行筛选。大约3200项专利关于银杏及其成分的文件。几乎所有这些都没有关联质量控制。在此期间出现的相关专利2001-2008年在适当的章节中提到。论文与上述化合物以外的主题或化合物组有关的作为制备分离物，没有方法学的定量结果，银杏成分的光谱或合成，无关植物药的成分，其他成分部分银杏树比叶，植物细胞生物技术，成品药，或与药用无关的叶成分不讨论活动。但是在表3、10、14和17中简短的概述与参考这些非讨论的论文提出了。关于分析和质量控制的小综述2002年以前出版的银杏叶及提取物可在[21]。最近对银杏各个方面的评论是发表在此。

2. 银杏叶及提取物中不同种类化合物的分析

2.1.萜烯三内酯

在G. biloba中出现的所有复合类中，TTLs是目前最受关注的。由于上一篇综述中出现了不少于130篇关于这些化合物分析的论文，因此在这里被引用和/或讨论。银杏内酯A、B、C(进一步简写为G-A、G-B、G-C)是银杏内酯A、B、C的三种主要ttl, 1932年首次分离得到[131]，1967年由中西(Nakanishi)[132]和Sakabe等[133]独立鉴定。一种名为G-M的小银杏内酯迄今只从根中分离出来。随后，在叶片中发现了一种与之密切相关的C15化合物bilobalide[134]和一种较小的TTL ginkgolide J (G-J)[135]。2001年，Wang等人报道了两种新的微量银杏内酯K和L[136,137]。后两种成分的发现尚未得到其他成分的证实。这些高度氧化萜烯的结构如图2所示。银杏TTLs因其独特的化学成分和对质量控制的重要性而受到广泛关注。银杏内酯是一种强效、选择性的血小板活化因子拮抗剂，但迄今为止，所有将最活跃的纯G-B转化为药物的尝试均以失败告终[138,139]。近年来，银杏内酯对甘氨酸受体的拮抗作用[140-142]，以及银杏内酯对缺血条件下甘氨酸释放的影响引起了广泛的关注[143]。BB还能阻断GABAA受体，而GABAA受体可能对BB的神经保护作用起部分作用[144]。对于银杏提取物的整体有益活性而言，多种化合物类和协同作用起着重要作用[145]。分别由Busch 、Kirschning [146], Str鴐gaard 、 Nakanishi [147] 和van Beek [148] 发表的有关银杏内酯的全合成、TTL的化学性质和生物学性质，以及银杏内酯的物理性质、色谱性质和光谱性质的综述。早期关于TTLs化学分析的综述出现在[19,20,149,150]。在接下来的几页中，我们将讨论2001年至2008年间发表的更有趣的分析论文，并重点介绍最佳的总体分析方法。

从技术上讲，银杏萜烯三内酯的化学分析可分为三个不同的部分:(1)提取、(2)样品净化和(3)分离检测后定量。应该详细描述这些步骤并彻底验证它们，但不幸的是，情况并非总是如此。下面将分别讨论提取、清除和分离/检测步骤，并在每个部分的末尾给出一些结论。之后，在范围、简单性、准确性、时间输入、必要的设备和验证方面得分最高的完整的定量分析将被突出显示。

2.1.1．提取

银杏内酯和银杏内酯在极性和中极性有机溶剂如低醇、四氢呋喃、丙酮和乙酸乙酯中均有良好的溶解性。它们在乙醚和水中中等溶解，不溶于氯仿、甲苯和己烷等非极性溶剂[148]。在较高的温度下，水的溶解度显著增加，在水或含有一定比例甲醇的水中进行回流是常用的方法[151]。纵观2001年以来发表的所有论文，有一种趋势是使用更高比例的甲醇，甚至纯甲醇，和超声波而不是回流。

甲醇含量高的一个可能的问题是，如果选择反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行分离，样品可能不能完全溶解在含ca. 65%水的LC洗脱液中。注入大量的纯甲醇会导致峰值畸变。对初始萃取溶剂影响的一些系统研究见:[16,152-155]。de Jager等人[156]认为，需要三次30分钟的超声才能达到定量提取。另一方面，Rimmer等人[94]报道了22 h Soxhlet提取后的值高于连续5次30分钟超声后的值。酶(纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶)辅助萃取虽然没有得到更高的收率，但确实导致了更多的杂质[157]。

因为双叶扁桃内酯的稳定性比银杏内酯差得多，在基本条件下[158-160]，一些较新的方法使用微酸性pH萃取来防止分解[161,162]。即使同时处理TTLs和黄酮醇糖苷，并结合HCl的水解步骤，似乎也不会导致BB的分解[163,164]，尽管G-A似乎受到了一定的影响[164]。在这方面有点奇怪的是使用了稍微碱性的溶液(pH 8)[165]。研究结果表明，该pH值仍然可以接受，但Lang和Wai[160]的论文提出了相反的观点。后一种方法是在100 bar和室温下，用含0.1%乙酸的水，静态提取NaCl与海砂混合叶片15min，动态提取叶片10-15min。他们比较了五种溶剂在回流条件下的结果，发现加压水萃取法对TTLs的回收率最高。相比之下，水和酒精的含量为83%。这种方法结合了高产、低人力投入和环境友好，但需要专门的设备。

此前已有研究表明，含二氧化碳的SFE可以用于银杏标准化提取物中TTLs的提取[166]。非极性成分的含量高，使其不具有抗氧化能力SFE在叶片上的直接应用。Yang等[167]使用超临界用5%乙醇改性二氧化碳制备精制而成GBEfroma粗提70%乙醇叶提取物。最佳SFE条件是300 bar和60℃。总提取率为2.1%以干叶为对照，TTL含量为7.3%。作者经经典方法测定，收率为1.8%，含量为2.7%溶剂萃取。Pan等[168]报道了一种预萃取方法与me2co轻石油(40:60)，以提高效率随后的SFE步骤。Yoo和Choi[169]就这种制剂申请了专利银杏提取物的SFE含量。总结一下，我们可以说有几种好的溶剂(沸水、甲醇或其混合物)叶中TTLs的提取及确切的成分影响其他化合物的浓度比实际浓度高TTL产量。在选择萃取溶剂时，保持良好已经在思想的分离和检测步骤和调整相应的样品清理。

2.1.2样本清理

自从第一次使用两个SPE对TTLs进行验证后在系列专栏[151,170]中，已经取得了许多进展。仍然在最近的两项研究[171,172]和作为另一项研究的基准[165]。一个常见的过程现在仍然是米歇尔。通常是用乙基三次萃取醋酸盐是使用后，有机提取物是汇集，蒸发再溶于甲醇[157,165,173-175]。朗和Wai[161]认为EtOAc-THF(4:1)可以对抗酸化水含NaCl比单独乙酸乙酯萃取效果更好。三篇论文使用了先前发表的涉及预萃取的程序用非极性有机溶剂接LLE对乙醚或甲基乙基酮[163,176,177]。相对非极性不适宜使用乙醚、二氯甲烷等溶剂用于TTLs的定量提取[178]再次由丁等人[165]。在同一项研究中也显示了这一点对于BB的最佳提取，pH值应介于两者之间3.5和5.0。Lang和wai[160]也发现了类似的结果。几组结合LLE步骤和SPE步骤[179-181]，但这不是获得可分析的萃取物是非常必要的。LLE步骤也可以使

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